lunes, mayo 10, 2010

Carta de la Dra. Judy Mikovitz. Boletín de la IACFS .Marzo 2010.Explicación Métodos para la Detección del Retrovirus XMRV.

Carta al Editor

Mikovits Judy A., PhD, Director de Investigación, Instituto Peterson Whittemore, Reno, Nevada

Desde la publicación del artículo de Science en octubre de 2009 relativa al virus de la leucemia murina Xenotropic relacionados (XMRV) en pacientes con síndrome de fatiga crónica (SFC) (1), se han producido tres trabajos publicados únicamente en la PCR que han sido incapaces de detectar este agente (2-4). A medida que estos documentos han generado preguntas sobre la presencia de XMRV en personas con síndrome de fatiga crónica, aquí queremos documentar los métodos exactos utilizados cuando XMRV se amplificó a partir de las muestras de pacientes. Instamos a los investigadores a no confiar únicamente en el ADN PCR en PBMCs sin activar, y ofrecemos nuestra ayuda si es necesario.

¿Por qué los informes de los estudios de PCR negativos que ocurren?

La primera posibilidad es que al igual que el HTLV-1 y, a diferencia del VIH-1, la distribución mundial de XMRV es baja, especialmente en Europa, y que las enfermedades crónicas tales como síndrome de fatiga crónica puede haber variado los desencadenantes ambientales en distintas partes del mundo. En nuestro trabajo posterior, desde la publicación del artículo de Science, hemos encontrado XMRV de personas de todo el mundo y creemos que esta explicación es poco probable.

Una segunda posibilidad es que hay mucha más diversidad de secuencias en XMRV que la publicada. Es decir, debido a diferencias de las cepas, la detección PCR se producirá sólo si el primer secuencias empleados son los adecuados para esa cepa en particular. Sin embargo, las secuencias de PCR por lo general son de regiones conservadas del genoma viral, por lo que esta explicación también puede ser poco probable.

La tasa de replicación para XMRV podría ser muy bajo y / o los niveles pueden fluctuar en un individuo dado en el tiempo. Esta explicación se pueden aplicar a las personas, pero es poco probable que se aplican a un gran número como los tres estudios negativos han utilizado. Sin embargo, si cualquiera de los tres últimos son verdaderas, PCR sola ronda de ADN genómico aislado de PBMCs, utilizando los cebadores basados en secuencias publicadas del uso de la PCR altamente específico basado en la secuencia de un clon molecular única, (VP62) podría no resultar en la amplificación de XMRV, incluso de un individuo infectado.

Una cuarta explicación es que células mononucleares de sangre periférica podría no ser el principal reservorio para el virus. Cabe señalar que a principios de infección por el VIH, la PCR de células mononucleares de sangre periférica no detectar el virus, ya que el embalse está en los macrófagos. Es sólo más tarde que las células CD4 infectadas y PCR de sangre periférica se vuelve positivo. De los estudios in vitro somos conscientes de tropismo de XMRV, sin embargo, ninguna investigación a fondo de tropismo in vivo se ha llevado a cabo hasta la fecha. Hay otras posibles explicaciones para la disparidad de resultados entre los Lombardi et al estudio y los únicos estudios de PCR-que actualmente están siendo exploradas.

Sin embargo, a pesar de la hipótesis actual de que la PCR proporciona respuestas a todas las preguntas, hay graves deficiencias en este supuesto, y los documentos de la polimerización en cadena de sólo rara vez son publicados sin datos de apoyo. Por esta razón, el papel de la ciencia empleada varias tecnologías biológicas otros al afirmar que XMRV es un retrovirus infeccioso, y un patógeno humano vinculado a las personas con síndrome de fatiga crónica. Cabe señalar que la cuestión de XMRV "causa" el síndrome de fatiga crónica no se debatió en el papel de la Science.

Debido a estos problemas, vamos a describir a continuación los métodos que y otros investigadores utilizan actualmente para detectar reproducible XMRV. Porque queremos compartir con exactitud la información técnica, lo siguiente será bastante técnica y, posiblemente, difícil para los clínicos. Una vez más nos gustaría ofrecer cualquier asistencia que pueda ser capaz de dar en la discusión de estos métodos.


AMPLIFICACIÓN MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN XMRV:

1) la transcripción reversa (RT) - [PCR]

Para evitar problemas de contaminaciones en el laboratorio de ADN, llevamos a cabo la PCR anidada con los reactivos por separado en una sala de laboratorio independientes designados sin amplicón copia de alta o el ADN del plásmido. Los controles negativos (ausencia de DNA o ADN añadido) fueron incluidos en cada experimento. Se utilizan dos métodos. TRIzol método se utiliza para extraer el ARN. PBMC (2-5 millones) o plasma (250 mL) se añaden a 1 ml de reactivo TRIzol (o 750 uL de reactivo TRIzol LS) y el ARN preparados de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La final precipitado de ARN se suspendió en 14 a 30 μL de agua libre de RNasa, y cuantificó a través de Quant-iT RiboGreen ARN (Invitrogen). La transcripción reversa (RT) de Super juego de la síntesis de cDNA Vilo (Invitrogen), cDNA fue hecha por una mezcla de oligo d (T) y la cartilla al azar con 2,5 mg de ARN total. Tras la optimización de la PCR anidada se reveló que un aumento de la plantilla de partida conduce a una reducción de falsos negativos.

Identificación de los genes gag y env XMRV se realizó por PCR en reacciones separadas. Las reacciones se llevaron a cabo de la siguiente manera: 750 a 1000 ng de DNA / DNA, 2 μL de 25 mM de MgCl2 25 u de HotStart-IT FideliTaq Master Mix (USB Corporation), 0,75 μL de cada una de 20 mM hacia adelante y marcha atrás iniciadores de los volúmenes de reacción de 50 mL. Para la identificación de mordaza, 419F (5'-ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3 ') y 1154R (5'-GCCGCCTCTTCTTCATTGTTCTC-3') fueron adelante y atrás cartillas. Para env, 5922F (5'-GCTAATGCTACCTCCCTCCTGG-3 ') y 6273R (5'-GGAGCCCACTGAGGAATC AAAACAGG-3') fueron utilizados. Por tanto gag y env PCR, 94 ° C durante 4 min de desnaturalización inicial se realizó para cada reacción seguida de 94 ° C durante 30 segundos, 57 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 1 minuto. 35 ciclos fue hecha por extensión final a 72 ° C durante 2 min. Para la segunda ronda de PCR, hibridación se realizó a 54 ° C durante 35 ciclos. Seis μL de cada producto de la reacción se cargó en geles de agarosa al 2% en tampón TBE con 1 kb + escalera de ADN como marcadores. Los productos de PCR se purificaron con Wizard SV Gel y PCR kit de limpieza (Promega) y secuenciados.

Por otra parte, en la primera ronda de PCR, cDNA se sintetiza seguida inmediatamente por la primera ronda de amplificación por PCR usando USB Taq polimerasa y la mezcla maestra de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando 0,5 ug de ARN como molde y el anteriormente descrito GAG-F542 de () y GAG-O (R1153) como el sentido y cebadores antisentido, respectivamente (1). La segunda ronda de PCR se realizó con 5 ul de la mezcla de reacción, los cebadores GAG-IF (F603) y GAG-IR (R1015) con 0,5 ul USB Taq polimerasa y el tampón PCR Invitrogen, complementada con una MgCl2 0,5 mm adicionales. Los productos de PCR fueron separados en un gel de agarosa al 1%, y los productos de PCR del tamaño esperado (413 pb) se recuperaron con un kit de extracción de gel de QIAEX II (Qiagen) y secuenciados. Utilizando un enfoque similar para la amplificación de secuencias de env utilizando los cebadores descritos anteriormente sólo dieron resultado en la amplificación de un pequeño porcentaje (<2%)>


AMPLIFICACIÓN 2-POR TRANSMISIÓN VIRAL PARA LNCaP (amplificación biológica)

Dos métodos se utilizan para detectar el virus después de la transmisión a las células LNCaP. La primera utiliza PCR anidada: Plasma de 20 mL de sangre anticoagulante es flash congelados y PBMC aisladas mediante centrifugación de densidad en Ficoll-Hypaque. Las CMSP se activan durante tres días RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, 1 mM de piruvato de sodio y antibióticos complementado con la APS (1 mg / mL) e IL-2 (20 unidades / mL). En 15 tubos de centrifugación ml, 5 x 105 LNCaP independiente, 1 x habilitado sin PBMC de IL-2 105 y 50-250 μL de plasma autólogo en 250 L de los medios RPMI completo se centrifugan durante 10 minutos a 1500 rpm. Todo el contenido de la pastilla de células se cultivan en un frasco T-25 en medio RPMI 1640 completo durante 4-5 días hasta que las células LNCaP son confluentes. A continuación se extrae el ADN de las células y PCR anidada para la mordaza se realiza como se describió anteriormente. Un compañero de donantes normales negativas siempre se ejecuta en las mismas condiciones.

AISLAMIENTO 3-VIRAL

plasmática de la célula libre (100-150 μL diluido a 300 L con medio de cultivo sin suero del tejido), se añadirá una placa de cultivo de seis y con la línea celular LNCaP (30-50% confluente). plasma normal negativo está incluido en un pocillo de cada plato como control. Las placas se centrifugan 5 min a 1500 RPM, se gira 180 º para evitar que se sequen parte de la cultura y se centrifuga de nuevo durante 5 min. Es importante minimizar la toxicidad de la placa y las condiciones pueden variar con el tipo de centrifugadoras utilizadas. Cada pozo se da 3-4 mL de RPMI completo. Para la transmisión de la célula-célula, 1 x 106 PBMC dado PHA, pero no IL-2 se añaden a una placa de cultivo de seis y con la línea celular LNCaP (30-50% confluente) se centrifuga y se cultivan como antes. Para la determinación de PCR en la celda / muestras de plasma son la cultura durante 5 días y luego la cosecha. Para el aislamiento viral, después de la incubación durante la noche, el plasma / PBMC se retira y los medios de comunicación fresca se agrega. Los cultivos crecen hasta confluente, ampliado mediante la transferencia a la T-75 matraz. aislamiento del virus Productiva se determina en el paso 2 por inmunotransferencia o detección por PCR y secuenciación.

En suma, hemos tenido éxito en la identificación de XMRV con los métodos anteriores. Seguimos confiando en que XMRV está relacionada con síndrome de fatiga crónica y otros estudios están procedimiento. Somos conscientes de que la investigación relativa al papel de XMRV en personas con síndrome de fatiga crónica y otras enfermedades neuro-inmunes está en su infancia, y esperamos ansiosamente a los nuevos conocimientos en este campo.


1. V Lombardi, Ruscetti F, J Garcia, M Pfost, K Hagen, Peterson D, et al. La detección de un retrovirus infeccioso, XMRV, en células de sangre de pacientes con el síndrome de fatiga crónica. Ciencia. 2009; 326 (5952) :595-89.
2. O Erlwein, S Kaye, M McClure, J Weber, sucesiones G, Collier D, et al. Fallo al detectar el XMRV novela en el síndrome de fatiga crónica. PLoS ONE. 2010; 5: e8519. doi: 10.1371/journal.pone.0008519.
3. Novio H, V Boucherit, K Makinson, Randal E, S Baptista, Hagen S, et al. La ausencia del virus de la leucemia murina xenotropic relacionada con el virus en los pacientes del Reino Unido con el síndrome de fatiga crónica. Retrovirología. 2010; 7 (10 [Epub ahead of print]).
4. Kuppeveld F, de Jong A, K Lanke, Verhaegh G, W Melchers, C Swanink, et al. La prevalencia del virus de la leucemia murina xenotropic relacionada con el virus en pacientes con síndrome de fatiga crónica en los Países Bajos: análisis retrospectivo de muestras de una cohorte establecida. BMJ 2010; 340 (doi: 10.1136/bmj.c1018).

Boletín de la IACFS / ME. 2010; 18 (1) :3-6. © 2010 IACFS / ME
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